Notizie - Monitoraggio dei livelli di ossigeno disciolto nel processo di fermentazione biofarmaceutica

Che cos'è l'ossigeno disciolto?

L'ossigeno disciolto (DO) si riferisce all'ossigeno molecolare (O_₂) che è disciolto in acqua. Differisce dagli atomi di ossigeno presenti nelle molecole d'acqua (H_₂O), presente nell'acqua sotto forma di molecole di ossigeno indipendenti, provenienti dall'atmosfera o generate attraverso la fotosintesi delle piante acquatiche. La concentrazione di ossigeno disciolto è influenzata da vari fattori, tra cui temperatura, salinità, flusso d'acqua e attività biologiche. Pertanto, costituisce un indicatore fondamentale per valutare lo stato di salute e di inquinamento degli ambienti acquatici.

L'ossigeno disciolto svolge un ruolo fondamentale nel promuovere il metabolismo microbico, influenzando la respirazione cellulare, la crescita e la biosintesi dei prodotti metabolici. Tuttavia, livelli più elevati di ossigeno disciolto non sono sempre benefici. Un eccesso di ossigeno può portare a un ulteriore metabolismo dei prodotti accumulati e potenzialmente causare reazioni tossiche. I livelli ottimali di ossigeno disciolto variano tra le diverse specie batteriche. Ad esempio, durante la biosintesi della penicillina, l'ossigeno disciolto viene in genere mantenuto a circa il 30% della saturazione dell'aria. Se l'ossigeno disciolto scende a zero e rimane a quel livello per cinque minuti, la formazione del prodotto può essere significativamente compromessa. Se questa condizione persiste per 20 minuti, possono verificarsi danni irreversibili.

Attualmente, i sensori di ossigeno disciolto più comunemente utilizzati possono misurare solo la saturazione relativa dell'aria, anziché la concentrazione assoluta di ossigeno disciolto. Dopo la sterilizzazione del terreno di coltura, si procede all'aerazione e all'agitazione fino a quando la lettura del sensore non si stabilizza, a quel punto il valore viene impostato al 100% di saturazione dell'aria. Le misurazioni successive durante il processo di fermentazione si basano su questo riferimento. I valori assoluti di ossigeno disciolto non possono essere determinati utilizzando sensori standard e richiedono tecniche più avanzate, come la polarografia. Tuttavia, le misurazioni della saturazione dell'aria sono generalmente sufficienti per monitorare e controllare i processi di fermentazione.

All'interno di un fermentatore, i livelli di ossigeno disciolto (DO) possono variare a seconda delle diverse regioni. Anche quando si ottiene una lettura stabile in un dato punto, possono comunque verificarsi fluttuazioni in determinati terreni di coltura. I fermentatori più grandi tendono a presentare maggiori variazioni spaziali nei livelli di OD, il che può influire significativamente sulla crescita e sulla produttività microbica. Prove sperimentali hanno dimostrato che, sebbene il livello medio di OD possa essere del 30%, le prestazioni di fermentazione in condizioni fluttuanti sono notevolmente inferiori rispetto a quelle in condizioni stabili. Pertanto, nell'ampliamento di scala dei fermentatori, al di là di considerazioni di similarità geometrica e di potenza, la minimizzazione delle variazioni spaziali di OD rimane un obiettivo di ricerca chiave.

Perché il monitoraggio dell'ossigeno disciolto è essenziale nella fermentazione biofarmaceutica?

1. Per mantenere l'ambiente di crescita ottimale per microrganismi o cellule
La fermentazione industriale coinvolge tipicamente microrganismi aerobici, come Escherichia coli e lievito, o cellule di mammifero, come le cellule ovariche di criceto cinese (CHO). Queste cellule svolgono il ruolo di "lavoratrici" all'interno del sistema di fermentazione, richiedendo ossigeno per la respirazione e l'attività metabolica. L'ossigeno funge da accettore terminale di elettroni nella respirazione aerobica, consentendo la produzione di energia sotto forma di ATP. Un apporto insufficiente di ossigeno può portare al soffocamento cellulare, all'arresto della crescita o persino alla morte cellulare, con conseguente fallimento della fermentazione. Il monitoraggio dei livelli di ossigeno disciolto (DO) garantisce che le concentrazioni di ossigeno rimangano entro l'intervallo ottimale per una crescita e una vitalità cellulare sostenute.

2. Per garantire una sintesi efficiente dei prodotti target
L'obiettivo della fermentazione biofarmaceutica non è semplicemente quello di promuovere la proliferazione cellulare, ma anche di facilitare la sintesi efficiente di prodotti target desiderati, come insulina, anticorpi monoclonali, vaccini ed enzimi. Questi percorsi biosintetici richiedono spesso un notevole apporto energetico, derivante principalmente dalla respirazione aerobica. Inoltre, molti sistemi enzimatici coinvolti nella sintesi dei prodotti dipendono direttamente dall'ossigeno. La carenza di ossigeno può interrompere o ridurre l'efficienza di questi percorsi.

Inoltre, i livelli di DO agiscono come un segnale regolatore. Sia concentrazioni eccessivamente elevate che basse di DO possono:
- Alterare i percorsi metabolici cellulari, ad esempio passando dalla respirazione aerobica alla fermentazione anaerobica meno efficiente.
- Innescare risposte di stress cellulare, portando alla produzione di sottoprodotti indesiderati.
- Influenzare i livelli di espressione delle proteine esogene.

Controllando con precisione i livelli di DO nelle diverse fasi della fermentazione, è possibile guidare il metabolismo cellulare verso la massima sintesi del prodotto target, ottenendo così una fermentazione ad alta densità e ad alta resa.

Introduzione al diagramma di flusso dell'acqua per i prodotti biofarmaceutici

3. Per prevenire la carenza o l'eccesso di ossigeno
La carenza di ossigeno (ipossia) può avere gravi conseguenze:
- La crescita cellulare e la sintesi dei prodotti cessano.
- Il metabolismo si sposta verso percorsi anaerobici, con conseguente accumulo di acidi organici come l'acido lattico e l'acido acetico, che abbassano il pH del terreno di coltura e possono avvelenare le cellule.
- L'ipossia prolungata può causare danni irreversibili, con un recupero incompleto anche dopo il ripristino dell'apporto di ossigeno.

Anche l'eccesso di ossigeno (sovrasaturazione) comporta dei rischi:
- Può indurre stress ossidativo e la formazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), che danneggiano le membrane cellulari e le biomolecole.
- Un'aerazione e un'agitazione eccessive aumentano il consumo energetico e i costi operativi, con conseguente spreco inutile di risorse.

4. Come parametro critico per il monitoraggio in tempo reale e il controllo del feedback

L'OD è un parametro in tempo reale, continuo e completo che riflette le condizioni interne del sistema di fermentazione. Le variazioni dei livelli di OD possono indicare in modo sensibile diversi stati fisiologici e operativi:
- La rapida crescita cellulare aumenta il consumo di ossigeno, causando una diminuzione dei livelli di DO.
- L'esaurimento o l'inibizione del substrato rallenta il metabolismo, riducendo il consumo di ossigeno e causando un aumento dei livelli di DO.
- La contaminazione da parte di microrganismi estranei altera il modello di consumo di ossigeno, provocando fluttuazioni anomale di DO e fungendo da segnale di allarme precoce.
- Anche malfunzionamenti delle apparecchiature, come guasti all'agitatore, ostruzioni nei tubi di ventilazione o incrostazioni nei filtri, possono causare un comportamento anomalo dell'ossigeno disciolto.

Integrando il monitoraggio DO in tempo reale in un sistema di controllo del feedback automatizzato, è possibile ottenere una regolazione precisa dei livelli di DO attraverso regolazioni dinamiche dei seguenti parametri:
- Velocità di agitazione: aumentando la velocità si migliora il contatto gas-liquido rompendo le bolle, migliorando così l'efficienza del trasferimento di ossigeno. Questo è il metodo più comunemente utilizzato ed efficace.
- Tasso di aerazione: regolazione della portata o della composizione del gas in ingresso (ad esempio, aumento della percentuale di aria o di ossigeno puro).
- Pressione del serbatoio: l'aumento della pressione aumenta la pressione parziale dell'ossigeno, migliorando così la solubilità.
- Temperatura: Abbassando la temperatura aumenta la solubilità dell'ossigeno nel terreno di coltura.

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